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研生試劑-細(xì)胞融合
更新時間:2014-05-15   點擊次數(shù):633次

                           研生試劑-細(xì)胞融合

細(xì)胞融合的步驟:

    1.制備飼養(yǎng)細(xì)胞層  一般選擇小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

與免疫小鼠相同晶系的小鼠,常用BALB/C小鼠,6~10周齡

拉頸處死,浸泡在75%乙醇內(nèi),3~5min

用無菌剪刀剪開皮膚,暴露腹膜

用無菌注射器注入5~6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液(嚴(yán)禁刺破腸管)

反復(fù)沖洗,吸出沖洗液

沖洗液放人10ml離心管,1 200r/min/分離5~6min

用20%小牛血清或胎牛血清的培養(yǎng)液混懸,調(diào)整細(xì)胞數(shù)至lXl0‘/ml

加入96孔板,100ul/孔

放人37℃C02孵箱培養(yǎng)

    2.制備免疫脾細(xì)胞  

zui后一次加強免疫3d后小鼠拉頸處死

無菌取脾臟,培養(yǎng)液洗1次

脾臟研碎,過不銹鋼篩網(wǎng)

離心,細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次

計數(shù)

取脾淋巴細(xì)胞懸液備用

    3.制備骨髓瘤細(xì)胞

般選用小鼠腹

取對數(shù)生長期骨髓瘤細(xì)胞離心

用無血清培養(yǎng)液洗2次

4.融合

    (1)將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1:10或1:5的比例混合在一起,在50m1離心管中用無血清不*培養(yǎng)液洗1次,離心,l 200r/min,8min;棄上清液,用吸管吸凈殘留液體,以免影響聚乙二醇(PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底,使細(xì)胞沉淀略松動。

    (2)90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1m1 45%PEG(分子量4 000)溶液,邊加邊輕搖。37℃水浴作用90s。

    (3)加37℃預(yù)溫的不*培養(yǎng)液以終止PEG作用,每隔2min分別加入lml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

    (4)離心,800r/rain,6min。

    (5)棄上清液,用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。

    (6)將上述細(xì)胞,加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孑L板內(nèi),每孔加100tzl。一般1個免疫脾臟可接種4塊96孔板。

    (7)將培養(yǎng)板置37℃、5%CO:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié),基本步驟是將兩種細(xì)胞混合后加入PEG使細(xì)胞彼此融合。然后用培養(yǎng)液稀釋PEG,消除PEG的作用。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋,分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。融合過程中有3個問題應(yīng)特別注意,①細(xì)胞比例,骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值可從1:2到1:10不等,常用1:4的比例。應(yīng)保證兩種細(xì)胞在融合前都具有較高活性。②反應(yīng)時間,在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中,第1分鐘滴加4。5ml培養(yǎng)液;間隔2rain滴加5ml培養(yǎng)液,然后加培養(yǎng)液50ml。③培養(yǎng)液的成分,良好的培養(yǎng)液對融合細(xì)胞尤其重要,其中的小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分均需嚴(yán)格配制。如融合效率降低,應(yīng)隨時核查培養(yǎng)基情況。

 

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